과학자들은 RNA 변형에 사용되고 동일한 계열의 다른 단백질과 다르게 작동하는 가장 작은 CRISPR-Cas13 시스템 중 하나인 CRISPR-Cas13bt3의 3차원 구조를 자세히 연구했습니다. 이 발견을 통해 도구의 정밀도가 향상되어 대상 편집 사이트에 대한 더 나은 액세스 및 전달이 가능해지며 잠재적으로 RNA를 표적으로 삼아 바이러스와 더 효과적으로 싸울 수 있습니다.

라이스대학교 과학자들은 RNA를 자르거나 변형하기 위해 알려진 가장 작은 CRISPR-Cas13 시스템 중 하나의 3차원 구조를 자세히 설명했으며, 그 결과를 사용하여 도구의 정밀도를 향상시키기 위해 도구를 추가로 수정했습니다. Nature Communications에 발표된 연구에 따르면, 이 분자는 같은 계열의 다른 단백질과 다르게 작동합니다.

이번 연구를 이끈 텍사스 암예방연구소의 생물학 조교수이자 학자인 양 가오(Yang Gao)는 “CRISPR 시스템에는 다양한 유형이 있는데 이번 연구의 초점은 CRISPR-Cas13bt3이라는 시스템이다”라고 말했다. "독특한 점은 매우 작다는 것입니다. 일반적으로 이와 같은 분자에는 약 1,200개의 아미노산이 포함되어 있는데, 이것은 약 700개에 불과하므로 이미 이점이 있습니다."

Emmanuel Osikpa(왼쪽부터)와 Deng Xiangyu

작은 크기는 대상 편집 사이트에 대한 더 나은 액세스 및 전달을 가능하게 한다는 장점이 있습니다. 일반적으로 DNA를 표적으로 하는 Cas9 단백질과 관련된 CRISPR 시스템과 달리 Cas13 관련 시스템은 DNA에 암호화된 유전 정보를 단백질 조립을 위한 청사진으로 변환하기 위한 중간 "지침"인 RNA를 표적으로 합니다.

연구자들은 이러한 RNA 표적화 시스템이 일반적으로 DNA가 아닌 RNA를 사용하여 유전 정보를 인코딩하는 바이러스와 싸우는 데 사용될 수 있기를 바라고 있습니다.

Gao Yang은 "내 연구실은 구조 생물학 연구실입니다."라고 말했습니다. "우리는 이 시스템이 어떻게 작동하는지 이해하려고 노력하고 있습니다. 따라서 우리 목표의 일부는 이를 3차원으로 볼 수 있고 그 메커니즘을 설명하는 데 도움이 되는 모델을 만드는 것입니다."

극저온 전자 현미경으로 만든 최소 CRISPR-Cas13bt3 분자 모델. 인식되어 절단되는 RNA는 연한 파란색으로 표시되고, 가위는 마젠타색과 청록색의 도메인으로 구성됩니다. CRISPR-Cas13bt3를 제어하는 ​​두 개의 루프는 각각 녹색과 빨간색으로 표시됩니다. 이미지 출처: 가오양 연구소/라이스대학교 제공

연구자들은 저온 전자 현미경을 사용하여 CRISPR 시스템의 구조를 매핑하고 얇은 얼음 층에 분자를 배치하고 이를 통해 전자 빔을 발사하여 데이터를 생성한 다음 상세한 3차원 모델로 처리했습니다. 결과는 그들을 놀라게 했습니다.

"우리는 이 시스템이 처음에 분리된 두 개의 도메인을 가지고 있는 Cas13 계열의 다른 단백질과 다른 메커니즘을 전개한다는 사실을 발견했습니다. 시스템이 활성화된 후에는 두 개의 도메인이 가위처럼 모여서 절단을 합니다. 이 시스템은 완전히 다릅니다. 가위는 이미 존재하지만 RNA 가닥을 올바른 표적 부위에 연결해야 합니다. 이를 위해 이 두 개의 독특한 루프에 있는 결합 요소를 사용하여 단백질의 서로 다른 부분을 함께 연결합니다."

Emmanuel Osikpa(왼쪽부터), Xue Sherry Gao, Xiangyu Deng, Jamie Smith, Seye J. Oladeji 및 Yang Gao. 사진 출처: Jeff Fitlow 사진/Rice University

Gao Yang 연구실의 박사후 연구원인 Xiangyu Deng은 "단백질과 RNA 복합체의 구조를 결정하는 것은 정말 어려운 일이며, 구조를 매핑할 수 있도록 단백질과 RNA 복합체를 보다 안정적으로 만들기 위해 많은 문제 해결을 수행해야 합니다."라고 말했습니다.

팀이 시스템의 작동 방식을 파악한 후, 화학 및 생체분자 공학자 Shirley Gao 실험실의 연구원들은 살아있는 세포에서 시스템의 활동과 특이성을 테스트하여 정확도를 높이기 위해 시스템을 조정하기 시작했습니다.

"우리는 이러한 시스템이 세포 배양 중에 더 쉽게 표적화할 수 있다는 것을 발견했습니다."라고 화학 및 생체분자 공학과의 Ted N. Law 조교수인 Sherry Gao가 말했습니다. "이 작업에서 정말 가치 있는 점은 상세한 구조 생물학 통찰력을 통해 높은 표적 RNA 편집 활동을 유지하면서 도구의 특이성을 개선하는 데 필요한 엔지니어링 노력을 합리적으로 식별할 수 있다는 것입니다."

Deng Xiangyu 사진 출처: JeffFitlow/Rice University

Xue Gao 연구실의 연구 조교인 Emmanuel Osikpa는 세포 실험을 수행하고 조작된 Cas13bt3가 높은 충실도로 특정 RNA 그룹을 표적으로 삼을 수 있음을 확인했습니다.

Osikpa는 "이 엔지니어링된 Cas13bt3가 원래 시스템보다 더 나은 성능을 발휘한다는 것을 보여줄 수 있었습니다."라고 말했습니다. "구조에 대한 포괄적인 연구는 대규모의 비용이 많이 드는 무작위 돌연변이 유발 스크린에 비해 표적화된 구조 중심 접근 방식의 장점을 강조했습니다."